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猪瘟蓝耳口蹄疫CSFV/PRRSV-U/FMDV-U荧光PCR说明书

【产品名称】

商品名称：猪瘟病毒/猪蓝耳病病毒通用型/口蹄疫病毒通用型(CSFV/PRRSV-U/FMDV-U)核酸检测试剂盒(实时荧光-PCR 法)

Name ：Classical swine fever virus / swine ear disease virus universal / foot-and-mouth disease virus universal (CSFV/PRRSV-U/FMDV-U) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence -PCR)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

口蹄疫病毒（FMDV）属小 RNA 病毒科属，是小的动物病毒之一，在世界范围广泛分布，其中，O、A、C 型 FMDV 的毒力和抗原性均易发生变易，几乎遍布亚、非、拉、欧各洲；AsiaⅠ型主要分布在亚洲；SATI、SAT2、SAT3 型主要分布在非洲[1-2]。口蹄疫病毒血清型复杂多变，为检测带来了较大的难度[3]。

本试剂盒适用于检测口蹄疫易感动物的水泡皮及水泡液、O/P 液等标本中口蹄疫病毒通用型 RNA，适用于口蹄疫病毒通用型感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对口蹄疫病毒通用型特异核酸序列设计引物和探针，用一步法荧光RT-PCR 技术对口蹄疫病毒通用型 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名 称 规 格

酶液 50μL×1 管

FMDV-U 反应液 1.0mL×1 管

FMDV-U 阳性质控品 50μL ×1 管

阴性质控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀动物，取水泡皮及水泡液；待检活动物，取 O/P 液 2~3mL。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

水泡皮样品：称取水泡皮 0.5g 于研磨器中研磨，加入生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；OP 液或水泡液样品，直接取 100μL 置于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 FMDV-U 反应液 酶液

用量 20μL 1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道

（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1 cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、

stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

6.质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线丏无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，丏 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【参考文献】

[1]Mulle JD，McEachern JA，Bossart KN，et al. Serotype-independent detection of foot-and-mouth disease virus [J]. J Virol Methods [J].2008，151（1）：146-153.

[2]吴绍强.亚欧型及南非型口蹄疫一步法多重荧光 RT-PCR 检测方法建立[J]. 中国农业科学，2010，43（14）：3019-3026.

[3]Mason PW，Grubman MJ，Baxt B. Molecular basis of pathogenesis of FMDV [J].Virus Res，2003，91（1）：9-32.

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