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禽白血病病毒J型(ALV-J)荧光PCR检测试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：禽白血病病毒J型（ALV-J）核酸检测试剂盒(RT-PCR 荧光探针法)

Name ：Diagnostic Kit for Avian Leukosis Virus type J RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)

【包装规格】48 份/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测的全血、带有白血细胞的血浆或血清、脾脏、肝脏、肾脏等标本中禽白血病病毒 J 型 RNA，适用于禽白血病病毒 J 型感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒用一对禽白血病病毒 J 型特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽白血病病毒 J 型 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名 称 规 格

酶液 50μl×1 管

ALV-J 反应液 1.0ml×1 管

ALV-J 阳性质控品 50μl ×1 管

阴性质控品 250μl ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 5 次，

有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ

Opticon2 等其他荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

疑似病鸡的全血、带有白血细胞的血浆或血清；疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标

本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

全血或带有白细胞的血浆、血清：无菌接种于长成单层的 CEF 或 DFI，置于含 5％

二氧化碳的 37℃恒温培养箱中培养，收集细胞提取 RNA；组织：，按脏器质量的 1

倍～2 倍加入灭菌生理盐水(含青霉素和链霉素各 1000 IU/mL)研磨，直至成匀浆液。

将悬液移至离心管中充分摇振后，4℃，10000r/rnin 离心 5min，收集上清液 100uL。

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取

法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性

对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 ALV-J 反应液 酶液

用量 20μl 1μl

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μl，分别加入相应的反

应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择：

检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿

选择 ROX 参比荧光。

4.3推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲

线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15

范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value

值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35.0<Ct 值≤37，建议重复检测，如果检测通道仍为 35.0<Ct

值≤37，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>37 或无 Ct 值。

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

8. 产品性能指标

阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率

为 100％。

低检测限：5.0×102copies/ml。

精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于等于 3%。

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