实验操作：

1.如果有N个样品，标记N+2个1.5-2mL螺旋盖塑料离心管，多出的一个为阳性对照，一个为阴性对照。为避免污染，建议不要使用压盖式塑料离心管。在每个管上做个标记，以在后续操作时区别向心面和离心面。

2.在离心管中分别加入0.2mL液体样品（血清、血浆、尿液、脑脊液、唾液、眼泪等等），阳性对照和阴性对照。

如果是口腔拭子、咽喉拭子等各种拭子样品，则将拭子放入0.2mL自备生理盐水中挤压出液体，然后取0.2mL进行提取。

如果是粪便等半固定样品，则取约0.3mL的样品，加入0.3自备生理盐水，震荡重悬，离心取0.2mL上清进行提取。

如果血液，细胞培养液等含细胞的液体，可以离心用上清，也可以直接取用，但后者提取的RNA中有细胞的基因组DNA污染。血浆的抗凝剂必须是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD时由于所加入ACD会增加体积，样品会被稀释，得到的病毒滴度会比使用 EDTA低15%左右。血浆按0.6mL/管的量分装保存，以避免反复冻融。

如果样品是实体组织或培养细胞，则需要在自备生理盐水中匀浆后离心，用0.2mL上清液（含病毒）进行提取，但此种情况下后得到的RNA不可避免的会含有基因组DNA 污染。

如果液体样品中的病毒需要富集，可以使用1.5mL上述方法得到的液体在4℃24000g 冷冻离心60分钟，移弃1.3mL、用剩下的0.2mL继续操作。

3.在每个离心管中加入0.6mL RNA病毒裂解液。RNA病毒裂解液在低温放置会产生结晶沉淀，需提前65℃水浴溶解并充分摇匀后取用。

4.室温放置10分钟裂解病毒。

5.振荡数秒后加入0.7mL室温异丙醇，旋紧盖后振荡30秒混匀，把离心管的向心面对向转头的中央，13000-15000g室温离心至少15分钟。

6.小心移弃上清，注意不要触及管底和管壁离心面的RNA沉淀（此时可能看不见）。

7.加入1.0mL室温70%乙醇，振荡数秒后15000g室温离心5分钟。注意：在离心机中放置离心管时将其向心面对向转头的中央。

8.小心移弃上清，注意不要触及管底和管壁离心面的RNA沉淀（此时呈膜状沉淀）。

9.再短暂离心数秒，用移液器移弃残留液体（70%乙醇），否则它会影响后续反应。

10.加入200μl RNase-free水或1×液相RNase Erasol(能灭活残留的RNase，而 RNase-free水无此功能)，用移液枪仔细吹打离心管管底和管壁离心面的膜状RNA沉淀，溶液将呈混浊状，含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有RNA，所以不要离心后取上清使用，必须取混合液使用，哪怕很浑浊。

11.直接取适量用于RT-PCR，如果溶于200uL水，同时样品使用量不超过RT-PCR体系的 1/2，不溶物一般不会影响RT-PCR。剩余样品可以室温放置2小时，也可保存于-80℃保存一个月。